堆肥用木质纤维素降解菌筛选技术规程DB13T5572-2022.pdf

ICS 13.080.99 CCS B 11 13 河北省地方标准 DB 13/T 55722022 堆肥用木质纤维素降解菌筛选技术规程 2022-05-31 发布 2022-07-01 实施 河北省市场监督管理局 发 布 DB 13/T 55722022 I 前言 本文件按照GB/T 1.12020标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规则的规定起草。本文件由河北省农业农村厅提出。本文件起草单位：河北工程大学。本标准主要起草人：柳焕章、刘建钗、陈凯、刘利强、刘会洽、吴志勇、姬国强、王春霞、张良、刘彦威、刘娜、刘孟啸、赵梓筱、董帅、赵海琪、杨硕、赵萍。DB 13/T 55722022 1 堆肥用木质纤维素降解菌筛选技术规程 1 范围 本文件规定了堆肥用木质纤维素降解菌菌株筛选的培养基配制、富集培养、菌株分离、初筛、复筛技术等。本文件适用于农林牧及加工业的有机废弃物堆肥、农作物秸秆还田，及其它行业和生活垃圾的有机废物中木质纤维素降解与资源化利用领域。本文件不适用于厌氧发酵和其他材料及形式的处理与利用。2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB 7959-87 粪便无害化卫生标准 GB 15618-2018 土壤环境质量 农用地土壤污染风险管控标准 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。3.1 木质纤维素 由纤维素、半纤维素和木质素组成的复合体，广泛存在于各种植物细胞壁中，是植物有机体和残体的主要构成物质，其结构致密、分解困难，与腐殖质形成有密切关系。4 缩略语 下列缩略语适用于本文件。CMC-Na：羧甲基纤维素钠；CMCase：羧甲基纤维素酶；DNS：3,5-二硝基水杨酸；Lip：木质素过氧化物酶；Mnp：锰过氧化物酶；Lac：漆酶 ABTS：2-联氨-双-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸。5 菌株筛选 包括样品采集、筛选培养基制备、木质纤维素降解菌的富集与分离、菌株初筛与复筛。筛选培养基配制 参见附录A。样品采集 从养殖场、有机肥厂、菌菇厂、垃圾填埋场、污水处理厂、林地和农田等场所采集发酵过程中的粪便、堆肥、菌菇发酵料、活性污泥、腐殖土和耕层土壤等，每种材料采样不少于20 g样品，避光冷藏，在24 h内进行富集或分离培养。富集培养 DB 13/T 55722022 2 称取各类样品各20 g，充分打散混匀；称取2份10 g混合样品，分别放入2个灭菌的含100 mL木质纤维素富集培养液的250 mL锥形瓶中，两瓶分别于35 和45、160 r/min摇瓶48 h。分离纯化 取上述富集悬液1.0 mL，依此倍比稀释至105稀释液；均匀涂布于细菌、放线菌、真菌分离培养基平板，2个重复，将稀释平板分别置于35 和45 条件下恒温培养1 d7 d。在培养期间每天观察菌落生长情况，并从适当稀释平板上挑取不同形态单菌落，在新的分离培养基平板上划线分离纯化培养；重复以上操作至得纯菌株。初筛 将分离纯化的菌株分别接种于CMC刚果红培养基、木质素苯胺蓝培养基、木质素亮蓝培养基上。每个平板接种一株菌，35 培养5 d。在明亮背景下观察、测量不同培养基上各菌落直径（d）及其周围透明圈的直径（D），并计算同一菌株透明圈直径与菌落直径比值（D/d）。在CMC刚果红培养基上D/d4，或在木质素苯胺蓝培养基或木质素亮蓝培养基上D/d1者为初筛入选菌株。复筛 5.6.1 纤维素酶活性测定 5.6.1.1 原理 采用3,5-二硝基水杨酸（DNS）法测定纤维素酶催化羧甲基纤维素钠（CMC-Na）降解产生的还原糖的含量，从而确定纤维素酶活性。酶活定义：在 pH 5.0、50 条件下，每 1 mL纤维素粗酶液在 1 min 内水解 CMC-Na 生成 1 g 的葡萄糖，称为1个 CMC 酶活力单位（U）。5.6.1.2 方法 取 10 mg 无水葡萄糖标准品，加入1 mL超纯水配制成 10 mgmL-1 葡萄糖溶液，再分梯度稀释为 1.0、0.8、0.6、0.4、0.2、0.1、0 mgmL-1。在540 nm处以0 mgmL-1 调零，读取各浓度梯度吸光值，以葡萄糖浓度为横坐标、吸光度为纵坐标建立标准曲线。将50的CMC-Na缓冲溶液和 50 L粗酶液样品组成 350 L反应体系，50 保温 30 min，反应后煮沸 5 min 终止反应获得糖化液，取50 L 糖化液，加入 150 L DNS 试剂混匀，再加入 1050 L 双蒸水，于紫外分光光度计下 540 nm 处测定吸光度。依据标准曲线计算糖化液的浓度。5.6.1.3 结果计算 纤维素酶活性按公式(1)计算：CL=1000XV反总（500V样V样总）T (1)