动物源金黄色葡萄球菌分离与鉴定技术规程 NYT4145-2022.pdf

动物源金黄色葡萄球菌分离与鉴定技术规程22中华人民共和国农业行业标准备案号：XXXX-XXXX67.120.10CCS X41452022Technical code of practice for isolation and identification ofStaphylococcus aureus from animals中华人民共和国农业农村部发 布2022?07?11发布2022?10?01实施41452022NY?/T414520222?前?言本文件按照?标准化工作导则?第?部分?标准化文件的结构和起草规则?的规定起草?请注意本文件的某些内容可能涉及专利?本文件的发布机构不承担识别专利的责任?本文件由农业农村部畜牧兽医局提出?本文件由全国兽药残留与耐药性控制专家委员会归口?本文件起草单位?中国兽医药品监察所?辽宁省检验检测认证中心?本文件主要起草人?宋立?李欣南?张纯萍?韩镌竹?赵琪?孙园媛?崔明全?邱月?动物源金黄色葡萄球菌分离与鉴定技术规程?范围本文件规定了动物源金黄色葡萄球菌?的分离与鉴定方法?本文件适用于动物生鲜乳?动物组织和上呼吸道拭子等样品中金黄色葡萄球菌的分离与鉴定?规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款?其中?注日期的引用文件?仅该日期对应的版本适用于本文件?不注日期的引用文件?其最新版本?包括所有的修改单?适用于本文件?分析实验室用水规格和试验方法?实验室?生物安全通用要求?术语和定义本文件没有需要界定的术语和定义?试剂或材料?要求除另有规定外?所有试剂均为分析纯?水为符合?规定的三级水?培养基按附录?配制或用商品化产品?试剂?过氧化氢溶液?柠檬酸钠?氰?羟基肉硅酸?氯化钠?甘油?溶液配制?过氧化氢溶液?取过氧化氢溶液?水?现用现配?柠檬酸钠溶液?取柠檬酸钠?加水?溶解?过滤?高压灭菌?备用?兔血浆溶液?取柠檬酸钠溶液?兔全血?按体积比?混匀?静置?或以?离心?使血液细胞下降?取上层清液?即得?无菌盐水?取氯化钠?溶于入?水中?高压灭菌?基质溶液?取?氰?羟基肉硅酸?按说明书配制溶液?或用市售商品?无菌生理盐水?取氯化钠?溶于?水中?高压灭菌?灭菌甘油?取甘油适量?灭菌?培养基制备?氏运输培养基?按照附录?中?的规定执行?氯化钠肉汤?按照?的规定执行?氯化钠胰酪胨大豆肉汤?按照?的规定执行?金黄色葡萄球菌显色培养基?按照说明书制备?营养琼脂?按照?的规定执行?脑心浸出液肉汤?按照?的规定执行?蔗糖脱脂乳保护剂?按照?的规定执行?标准菌株金黄色葡萄球菌?材料?菌种冷冻保存管或磁珠保存管?革兰氏阳性细菌鉴定卡?盒?仪器设备?恒温培养箱?冰箱?或以下?恒温水浴锅?分析天平?感量?二级生物安全柜?高压灭菌器?显微镜?麦氏浊度仪或标准麦氏比浊管?微生物生化鉴定系统?微生物质谱仪?样品采集与保存运输?混合生鲜乳样品灼烧储奶罐出料口?打开出料阀?弃去前段生鲜乳?接取?于无菌容器中?保存?运输?不宜超过?或?冷冻保存?运输?个体生鲜乳样品先用碘伏擦拭消毒动物乳头及周边?弃前?把乳汁?挤取?乳汁于无菌容器?保存?运输?不宜超过?或?冷冻保存?运输?扁桃体或发病组织取扁桃体或发病动物组织?置于无菌塑封袋或其他无菌密闭容器?保存?运输?不宜超过?咽?喉拭子取灭菌棉签?插入喉头口及上颚裂处?擦拭数次?取出?置于?氏运送培养基中?保存?运输?不宜超过?鼻拭子取灭菌棉签?插入鼻腔?旋转数次?取出?置于?氏运送培养基中?保存?运输?不宜超过?分离与鉴定流程分离与鉴定流程见图?图?金黄色葡萄球菌分离与鉴定程序?增菌取生鲜乳?动物组织?或上呼吸道拭子?份?接种于?氯化钠肉汤或?氯化钠胰酪胨大豆肉汤?中?振荡混匀?增菌培养?分离纯化取增菌液?接种于金黄色葡萄球菌显色平板?或将动物组织或上呼吸道拭子直接接种于金黄色葡萄球菌显色平板?培养?观察平板上菌落的状态?根据金黄色葡萄球菌显色培养基说明书中描述?挑取可疑菌落?接种于营养琼脂平板?培养?纯化?备用?筛查与鉴定?筛查?形态学检查取纯化菌落?革兰氏染色?镜检?呈葡萄球状排列?无芽孢?无荚膜?触酶试验取营养琼脂上的新鲜培养物?置于洁净载玻片上?滴加?过氧化氢溶液?滴?观察?立即产生气泡的即为触酶试验阳性?血浆凝固酶试验取新鲜配制的兔血浆?加入触酶试验为阳性?营养琼脂上的新鲜培养物?个?个单菌落?振荡摇匀?置?菌落?振恒温培养箱或水浴内?每?观察一次?观察?次?如呈现凝固?即将试管倾斜或倒置时?呈现凝块?或凝固体积大于原体积的一半?判定为阳性?同时以血浆凝固酶试验阳性和阴性葡萄球菌菌株的培养物作为对照?可使用商品化的试剂并按其产品说明书操作?进行血浆凝固酶试验?鉴定?通用要求生化鉴定与质谱鉴定任选其一?生化鉴定将触酶和血浆凝固酶试验阳性的待鉴定菌株接种