有机肥中活性大肠杆菌快速测定PMA-qPCR法DB12T1271-2023.pdf

ICS 65.080 CCS B 10 12 天津市地方标准 DB12/T 12712023 有机肥中活性大肠杆菌快速测定 PMA-qPCR法 Rapid detection of live Escherichia coli in organic fertilizer by PMA-qPCR method (点击此处添加与国际标准一致性程度的标识)2023-11-07 发布 2023-12-08 实施 天津市市场监督管理委员会 发 布 DB12/T 12712023 I 前言 本文件按照GB/T 1.12020标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规则的规定起草。本文件由天津市农业农村委员会提出并归口。本文件起草单位：天津市农业科学院畜牧兽医研究所、农业农村部环境保护科研监测所。本文件主要起草人：张蕾、田雪力、池晶晶、路超、杨春蕾、韩静、王丽丽、白朋勋。DB12/T 12712023 1 有机肥中活性大肠杆菌快速测定 PMA-qPCR 法 1 范围 本文件规定了有机肥中活性大肠杆菌PMA-qPCR测定方法的试剂与引物、主要仪器设备、样品采集、检测步骤和检测结果等技术内容。本文件适用于有机肥中活性大肠杆菌的检测。2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 GB/T 19438.1 禽流感病毒通用荧光RT-PCR检测方法 GB 19489 实验室 生物安全通用要求 NY/T 525 有机肥料 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。3.1 活性大肠杆菌 live Escherichia coli 在一定条件下可以引起人和多种动物发生胃肠道感染或尿道等多种局部组织器官感染的致病菌。3.2 暗反应 dark reaction 二氧化碳在植物细胞内，经一连串酵素反应，被还原成为葡萄糖的过程。3.3 光反应 light reaction 光合作用中，光能转变成为化学能的过程。4 缩略语 下列缩略语适用于本文件。PMA：叠氮溴化丙锭（propidium monoazide）PCR：聚合酶链式反应（polymerase chain reaction）qPCR：实时荧光定量 PCR（quantitative real-time PCR）SYBR Green I：核酸凝胶染料(SYBR green nucleic acid gel stains)ROX:参比染料（ROX reference dye）5 原理 DB12/T 12712023 2 PMA是光敏DNA染料，可与DNA发生不可逆的共价交联反应。PMA无法透过活性细菌完整的细胞膜，但可以进入死亡细菌受损细胞膜，并永久修饰其DNA，阻断DNA的PCR扩增。在强光照射下，游离在溶液中未与核酸交联的剩余PMA可与水分子反应，生成没有活性的羟胺。羟胺不会对后续从活细菌提取的DNA进行修饰，不影响DNA正常扩增。样品经PMA预处理后再进行DNA提取及PCR扩增，可以克服常规PCR无法区分活性细菌与死亡细菌释放出的游离DNA的缺陷，有效避免PCR检测中的假阳性结果。6 试剂与引物 试剂 6.1 6.1.1 除另有规定外，试剂均为分析纯或生化试剂。试验用水应符合 GB/T 6682 中二级水的要求。6.1.2 PMA 储备液（5g/L）：1mg PMA 溶于 200L 20%的 DMSO 溶液中，-20避光保存。6.1.3 PMA 工作液：将 PMA 储备液以 20%DMSO 溶液稀释 10 倍。6.1.4 0.01 mol/L（pH7.2）PBS：配方见 GB/T 19438.1 附录 A。6.1.5 95%乙醇。6.1.6 DNA 提取试剂盒。6.1.7 SYBR Premix Ex Taq 染料法实时荧光定量试剂盒：内含TaKaRa Ex Taq HS，dNTP Mixture，Mg2+，Tli RNaseH，SYBR Green I。根据 qPCR 仪型号选用 ROX 或 ROX II 校正。6.1.8 qPCR 标准品：含有目的基因的克隆质粒，也可采用经纯化后的基因组 DNA。引物 6.2 大肠杆菌uidA基因qPCR扩增所用引物见表1。表1 大肠杆菌uidA基因 qPCR 扩增引物 引物名称 引物序列 引物浓度 扩增产物大小 上游引物UAL1939b 5-ATGGAATTTCGCCGATTTTGC-3 10moL/L 167 bp 下游引物UAL2105b 5-ATTGTTTGCCTCCCTGCTGC-3 10moL/L 7 主要仪器设备 超净工作台、冰箱（0 4）、分