香石竹斑驳病毒的检测 荧光定量PCR法NYT4430-2023.pdf

2023?12?22发布2024?05?01实施香石竹斑驳病毒的检测荧光定量PCR法04中华人民共和国农业行业标准备案号：XXXX-XXXX65.020.01CCS B44302023Detection of carnation mottle virusReal-time fluorescent PCR method中华人民共和国农业农村部发 布N Y/T 前言本文件按照G B/T 标准化工作导则第部分:标准化文件的结构和起草规则 的规定起草.请注意本文件的某些内容可能涉及专利.本文件的发布机构不承担识别专利的责任.本文件由农业农村部种植业管理司提出并归口.本文件主要起草单位:云南省农业科学院花卉研究所、云南农业大学、中国农业大学、云南云科花卉有限公司、玉溪云星生物科技有限公司、国家观赏园艺工程技术研究中心、农业农村部花卉产品质量监督检验测试中心(昆明)、云南省花卉育种重点实验室、云南省花卉工程技术研究中心、云南省花卉标准化技术委员会、昆明市花卉遗传改良重点实验室.本文件主要起草人:瞿素萍、张艺萍、刘冠泽、王丽花、王继华、杨秀梅、高俊平、杨春梅、许凤、张丽芳、马男、苏艳、邹凌、蒋亚莲、单芹丽、莫锡君.N Y/T 香石竹斑驳病毒的检测荧光定量P C R法范围本文件规定了香石竹斑驳病毒(c a r n a t i o nm o t t l ev i r u s,C a r MV)的荧光定量P C R检测方法.本文件适用于香石竹(D i a n t h u s c a r y o p h y l l u s)栽培品种的种苗、植株及其他组织中香石竹斑驳病毒的检测和判定.规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款.其中,注日期的引用文件,仅该日期对应的版本适用于本文件;不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件.G B/T 分析实验室用水规格和试验方法术语和定义下列术语和定义适用于本文件.外壳蛋白基因 c o a tp r o t e i ng e n e编码病毒外壳蛋白的基因,可作为病毒检测的靶标,简称c p基因.T a q M a n探针T a q M a np r o b e s一种检测寡核苷酸的荧光探针,其 末端携带荧光基团(如F AM、T E T、V I C、HE X等),端携带淬灭基团(如T AMR A、B HQ等).缩略语下列缩略语适用于本文件.C a r MV:香石竹斑驳病毒(C a r n a t i o nm o t t l ev i r u s)C t值:每个反应管内的荧光信号达到设定的阈值时所经历的循环数(c y c l e t h r e s h o l d)D E P C:焦炭酸二乙酯(d i e t h yp y r o c a r b o n a t e)d NT P s:脱氧核苷三磷酸混合液(d e o x y n u c l e o s i d et r i p h o s p h a t em i x t u r e),由种脱氧核糖核苷酸d AT P、d G T P、d T T P、d C T P等量混合而成的溶液P C R:聚合酶链式反应(p o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n)T r i s:三(羟甲基)氨基甲烷t r i s(h y d r o x y m e t h y l)a m i n o m e t h a n e香石竹斑驳病毒的基本信息香石竹斑驳病毒属番茄丛矮病毒科(T o m b u s v i r i d a e)麝香石竹斑驳病毒属(C a r m o v i r u s)典型成员.详细信息见附录A.原理利用香石竹斑驳病毒C P基因的高度保守区域的一段 b p序列设计实时荧光引物和探针,根据香石竹斑驳病毒的实时荧光P C R检测结果对香石竹斑驳病毒进行检测鉴定.仪器和设备 实时荧光定量P C R仪.N Y/T 电泳仪.凝胶成像系统.超微量紫外可见光分光光度计.高速冷冻离心机:离心力 g以上.超低温冰箱:.冰箱:,.微量移液器:量程分别为 L L、L L、L L、L L、L L、L L.电子天平:感量为 g.生物安全柜:洁净度 级以上.超净工作台:洁净度 级以上.试剂与耗材除非另有规定,在检测中仅使用分析纯或生化试剂;所有试剂均用无R NA酶的容器分装;实验用水符合G B/T 的二级水指标,其中涉及P C R扩增的用水应符合G B/T 一级水指标.d NT P s:浓度为 mm o l/L.D E P C处理的灭菌纯水.引物:正向引物:C G GAT AG T C T T G T C AA C AT A C G G ;反向引物:C C T T AT C G T T G C T T