病原微生物菌（毒）种分离和鉴定方法 施万菌TCPMA 032-2023.pdf

ICS 11.020 CCS C 04 团体标准 T/CPMA 0322023 病原微生物菌（毒）种分离和鉴定方法 施万菌 Isolation and identification of pathogenic microorganismsShewanella spp.2023-10 20 发布 2023-10-20 实施 中华预防医学会 发 布T/CPMA 0322023 I 目次 前言.II 1 范围.1 2 规范性引用文件.1 3 术语和定义.1 4 缩略语.1 5 设备和材料.1 6 培养基和试剂.1 7 分离和鉴定程序.2 8 操作步骤.3 样品类型和处理.3 增菌.3 分离培养.3 初步鉴定.3 微生物自动鉴定系统实验.4 PCR 确证实验.4 附录A （资料性）施万菌病原学.7 附录B （规范性）设备和材料.8 附录C （规范性）培养基和试剂.9 C.1 施万菌增菌液.9 C.2 硫代硫酸盐柠檬酸盐胆盐蔗糖（TCBS）琼脂.9 C.3 营养琼脂.9 C.4 三糖铁琼脂（TSI）.9 C.5 氧化酶试剂.10 C.6 5TBE 电泳缓冲液.10 附录D （规范性）施万菌种水平的鉴定（MLSA 法）.11 D.1 核酸模板制备.11 D.2 PCR 反应体系.11 D.3 PCR 扩增条件.11 D.4 扩增产物分析.11 D.5 构建 MLSA 进化树.11 D.6 结果判定.12 参考文献.13 T/CPMA 0322023 II 前言 本文件按照GB/T 1.12020标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规则的规定起草。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。本文件由中国疾病预防控制中心传染病预防控制所提出。本文件由中华预防医学会归口。本文件起草单位：中国疾病预防控制中心传染病预防控制所、马鞍山市疾病预防控制中心、中国疾病预防控制中心、中日友好医院、北京市顺义区疾病预防控制中心。本文件主要起草人：王多春、汪永禄、魏强、卢金星、阚飙、鲁炳怀、李颖、朱明、姜孟楠、代航、蔡红艳、肖悦、高鹤、白雪梅。T/CPMA 0322023 1 病原微生物菌（毒）种分离和鉴定方法 施万菌 1 范围 本文件规定了施万菌的分离和鉴定方法。本文件适用于全国各级病原微生物菌（毒）种保藏机构，以及涉及人间传染的施万菌研究、教学、检测、诊断等相关活动的机构。2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。T/CPMA 011 病原微生物菌（毒）种保藏数据描述通则 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。施万菌属 Shewanella spp.革兰染色阴性菌、具有单极鞭毛、兼性厌氧，主要生化特征为氧化酶、过氧化氢酶阳性，可产 H2S，广泛分布于海洋环境和水生生物中，可造成海产品、禽畜肉制品腐败，是水生动物和人类的机会致病菌，在人体可导致皮肤和软组织感染、菌血症、肝胆疾病、中耳炎和其他感染。注：详细资料参见附录 A。4 缩略语 下列缩略语适用于本文件。bp：碱基对（Base pair）MLSA：多位点序列分析（Multilocus Sequence Analysis）PCR：聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction）5 设备和材料 见附录B。6 培养基和试剂 T/CPMA 0322023 2 见附录 C。7 分离和鉴定程序 分离和鉴定流程见图 1。图1 施万菌分离鉴定流程图 样品（临床、食品、环境）增菌：施万菌增菌液 分离培养：TCBS 平板 36 1，18 h24 h 直径 1-3mm、圆形、光滑凸起、绿色不透明，带或不带黑色中心 初步鉴定：革兰染色（-），氧化酶（+），三糖铁琼脂反应为斜面产碱、底层产酸、产硫化氢 微生物鉴定系统鉴定实验 PCR 确证实验 报告检出施万菌 MLSA 分析（种水平鉴定，可选）rpoA 特异基因（+）营养琼脂平板 36 1，18 h24 h 样品处理 36 1，18 h24 h T/CPMA 0322023 3 8 操作步骤 样品类型和处理 8.1.1 样品类型 8.1.1.1 临床样品：包括粪便、尿液、呕吐物、痰液、脑脊液、肛拭子、皮肤化脓性病灶等。8.1.1.2 食品样品：包括乳制品、肉制品、水产制品、即食蛋制品、粮食制品、即食豆制品、即食果蔬制品等预包装食品。8.1.1.3 环境样品：包括水体、市场各水产或肉类档口、各超市生鲜类柜台和餐厅厨房的环境，包括案板、器具物表、餐具、储存冰箱或冷库内表面、污水、工作人员手部等多点涂抹样品。8.1.2 样品处理 8.1.2.1 临床样品：以无菌