鱼类贝类环境DNA识别技术规范DB11T2023-2022.pdf

ICS 13.020.01 CCS Z 01 DB11 北京市地方标准 DB11/T 20232022 鱼类贝类环境 DNA 识别技术规范 Technical regulations for fish and shellfish identification using environmental DNA 2022-09-29 发布 2023-01-01 实施北京市市场监督管理局 发 布 DB11/T 20232022 I 目 次 前言.II 1 范围.1 2 规范性引用文件.1 3 术语和定义.1 4 鱼类贝类 eDNA 识别程序.2 5 试剂和器具.2 6 水样采集.4 7 水样富集.5 8 DNA 提取和纯化.5 9 PCR 扩增.6 10 测序及结果分析.7 11 质量保证与质量控制.8 附录 A（资料性）8 碱基条形码参考序列.9 参考文献.10 DB11/T 20232022 II 前 言 本文件按照GB/T 1.12020标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则的规定起草。本文件由北京市水务局提出并归口。本文件由北京市水务局组织实施。本文件起草单位：北京市水文总站（北京市水务局水质水生态监测中心）、中国科学院生态环境研究中心、首都师范大学。本文件主要起草人：黄振芳、刘波、杨蓉、李世国、王忠锁、王东霞、徐斌、赵红磊、叶燕慧、郭伟、徐冉、唐女、孙春媛、张满富、吕喆、王浩、王玉璠、吴玉梅、王雪莲、刘芳、焦振寰、陶亮、薛晨旺。DB11/T 20232022 1 鱼类贝类环境 DNA 识别技术规范 1 范围 本文件规定了鱼类贝类环境DNA（eDNA）识别的对象、技术方法、采集和实验分析等技术要求。本文件适用于河流、湖泊、水库和渠道等地表水域的鱼类和贝类eDNA识别。2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 SL 219 水环境监测规范 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。3.1 鱼类 fish 以鳃呼吸、凭上下颌摄食并通过尾和躯干摆动以及鳍的协调作用游泳的水生脊椎动物，是软骨鱼纲和硬骨鱼纲动物的统称。3.2 贝类 shellfish 具三胚层、真体腔的软体动物，为底栖动物中的重要功能类群，主要包括双壳类（如蚌类、贻贝）和腹足类（如螺类）。3.3 环境 DNA environmental DNA(eDNA)从生物生活环境中直接提取到的不同物种DNA的总和，包含动植物脱落的细胞或游离的DNA，可提供一个环境中生活物种的存在记录。3.4 聚合酶链式反应 polymerase chain reaction(PCR)一种用于扩增特定DNA片段的分子生物学技术，包括变性、退火、延伸等主要步骤。DB11/T 20232022 2 3.5 分类操作单元 operational taxonomic unit(OTU)在系统发生学或群体遗传学研究中设定的特定标志，可鉴别生物分类单元（品系、种、属等）。一般把碱基序列相似度不小于97%的OTU定义为一个物种。3.6 引物条形码 barcode 为高通量测序时区分不同样点来源的物种基因序列，在扩增引物5端增加的序列特异性短片段标记。4 鱼类贝类 eDNA 识别程序 鱼类贝类eDNA识别程序见图1。图1 鱼类贝类 eDNA 识别程序 5 试剂和器具 5.1 试剂 除非另有说明，试剂均使用符合国家标准的分析纯试剂，试验用水均使用满足GB/T 6682中一级水要求的新制备的超纯水。具体要求如下：次氯酸钠：化学纯；消毒液：次氯酸钠和蒸馏水配制，有效氯浓度 5.5%6.5%（质量分数）；DB11/T 20232022 3 无水乙醇：化学纯，分析纯；75%乙醇：无水乙醇和超纯水 3:1 配制，其中消毒用 75%乙醇可使用化学纯无水乙醇和蒸馏水3:1 配制；70%乙醇：无水乙醇和超纯水 7:3 配制；乙二胺四乙酸（EDTA）；氢氧化钠（NaOH）；EDTA 溶液，（EDTA）=0.02 mol/L：称取 5.8448 g EDTA 溶于适量超纯水中，NaOH 固体调节 pH 至 8.0，定容至 1000 mL，121灭菌 18 min，冷却后常温保存；EDTA 溶液，（EDTA）=0.5 mol/L：称取 14.612 g EDTA 溶于适量超纯水中，NaOH 固体调节 pH 至 8.0，定容至 100 mL，121灭菌 18 min，冷却后常温保存；三羟甲基氨基甲烷盐酸盐（Tris-HCl）；浓盐酸；Tris-HCl 溶液，（Tris-HCl）=0.1 mol/L：称取 15.76