动物源沙门氏菌分离与鉴定技术规程NYT4146-2022.pdf

动物源沙门氏菌分离与鉴定技术规程22中华人民共和国农业行业标准备案号：XXXX-XXXX67.120.10CCS X41462022Technical code of practice for isolation and identification of Salmonellafrom animals中华人民共和国农业农村部发 布2022?07?11发布2022?10?01实施41462022NY?/T414620222?前?言本文件按照?标准化工作导则?第?部分?标准化文件的结构和起草规则?的规定起草?请注意本文件的某些内容可能涉及专利?本文件的发布机构不承担识别专利的责任?本文件由农业农村部畜牧兽医局提出?本文件由全国兽药残留与耐药性控制专家委员会归口?本文件起草单位?中国兽医药品监察所?中国动物疫病预防控制中心?本文件主要起草人?张纯萍?李颖?赵琪?叶子煜?宋立?刘洪斌?崔明全?蔡英华?徐士新?于?王鹤佳?动物源沙门氏菌分离与鉴定技术规程?范围本文件规定了动物源沙门氏菌?的分离与鉴定方法?本文件适用于动物直肠?泄殖腔拭子?新鲜粪便?肠道内容物等样品中沙门氏菌的分离和鉴定?规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款?其中?注日期的引用文件?仅注日期对应的版本适用于本文件?不注日期的引用文件?其最新版本?包括所有的修改单?适用于本文件?食品安全国家标准?食品微生物学检验?沙门氏菌检验?分析实验室用水规格和试验方法?实验室?生物安全通用要求?术语和定义本文件没有需要界定的术语和定义?试剂或材料?要求除另有规定外?所有试剂均为分析纯?水为符合?规定的三级水?培养基按附录?配制或用商品化产品?试剂?氯化钠?聚合酶链式反应预混液?琼脂糖?氰?羟基肉硅酸?色谱纯?缓冲液?甘油?溶液制备?无菌生理盐水?取氯化钠?加水适量使溶解并稀释至?高压灭菌?基质溶液?取?氰?羟基肉硅酸?按说明书配制或用市售商品?灭菌甘油?取丙三醇适量?高压灭菌?缓冲液?取?缓冲液?加水定容至?琼脂糖凝胶?取琼脂糖?于?中加热?充分溶解?培养基制备与缓冲溶液?氏运送培养基?按照附录?中?的规定执行?蛋白胨水缓冲液?按照?的规定执行?四硫磺酸钠煌绿?增菌液?按照?的规定执行?亚硒酸盐胱氨酸?增菌液?按照?的规定执行?氯化镁孔雀绿?增菌液?按照?的规定执行?营养琼脂?按照?的规定执行?沙门氏菌属显色培养基?按说明书制备?蔗糖脱脂乳保护剂?按照?的规定执行?标准菌株肠炎沙门氏菌?材料?生化鉴定试剂盒或鉴定卡?磁珠保藏管?仪器设备?二级生物安全柜?恒温培养箱?冰箱?或以下?分析天平?感量?生物显微镜?计或精密?试纸?高速冷冻离心机?离心速度?麦氏比浊仪?微生物生化鉴定系统?仪?核酸电泳仪?配水平电泳槽?电泳凝胶成像分析系统?微生物质谱仪?分离与鉴定流程分离与鉴定流程见图?样品采集与保存运输取灭菌棉签?插入直肠?泄殖腔?旋转数次?取出?置于?氏运送培养基中?取肠道内容物或粪便?置于无菌塑封袋或其他密闭容器中?保存?运输?不宜超过?增菌?预增菌?动物直肠?泄殖腔拭子取单个动物直肠?泄殖腔拭子?置于?中?培养?进行预增菌?粪便?肠道内容物取?新鲜粪便?肠道内容物?置于?中?稀释?混匀?调节?至?培养?进行预增菌?增菌取预增菌液?转接于?增菌液?增菌培养?同时?另取预增菌液?转接于?增菌液?于?增菌培养?或转接于?增菌液?于?增菌培养?也可使用其他市售适合沙门氏菌增菌液?按照说明书操作?图?沙门氏菌分离与鉴定流程?分离纯化取增菌液?接种于沙门氏菌显色培养基或?琼脂培养基?于?培养?观察平板上菌落的状态?根据培养基说明书中描述?挑取可疑菌落?接种于营养琼脂平板?培养?纯化?备用?也可参考?的?分离执行?形态学检查与鉴定?形态学检查取纯化菌落?革兰氏染色?镜检?呈红色?短直杆菌?大多数周生鞭毛?无芽孢?无荚膜?鉴定?通用要求生化鉴定?鉴定?质谱鉴定?种方法任选其一?生化鉴定按照?的?生化试验执行?也可以使用生化鉴定试剂盒?鉴定卡或生化鉴定仪鉴定?鉴定?模板制备取新鲜菌落?加灭菌水?煮沸?冷却?离心?取上清液?备用?肠炎沙门氏菌标准菌株作为阳性对照?水为阴性对照?引物引物序列及扩增片段长度见表?表?沙门氏菌的?引物序列及扩增片段长度细菌引物序列扩增片段长度?沙门氏菌?上游引物?下游引物?扩增?反应体系?见表?表?反应体系试剂体积?上游引物?下游引物?水?模板?反应条件?预变性?变性?退火?延伸?个循环?延伸?电泳取?扩增产物?于?的琼脂糖凝胶中电泳?凝胶成像分析?结果判定扩增条带大小符合?的为阳性?必要时测序鉴定?沙门氏菌?产物大小和测序结果见附录?中?和?质谱鉴定?菌样制备挑取单个新鲜纯化菌落?均匀涂布于靶板样品孔中?涂布厚度为薄薄一层?室温干燥?吸取